Il giardino venne fondato il 17 ottobre 1755, per volere di Ferdinando VI, e ubicato nell'Orchard di Migas Calientes, vicino all'odierna Puerta de Hierro, sulle rive del Manzanarre. Conteneva più di 2000 piante raccolte da José Quer y Martínez, botanico e medico.
Nel 1774 Re Carlo III ordinò il suo trasferimento nel sito attuale del Paseo del Prado, affidandone la progettazione agli architetti Francesco Sabatini e Juan de Villanueva che organizzarono il giardino in tre terrazze a più livelli, sistemando le piante secondo il metodo di Linneo. Questo nuovo sito fu inaugurato nel 1781. La sua missione non era solo quella di esporre le piante, ma anche di insegnare la botanica, promuovere spedizioni per la scoperta di nuove specie di piante e di classificarle. L'erbario è il più grande in Spagna, e ha ora ha oltre un milione di esemplari.
Il giardino venne ampliato con l'inserimento di 10000 piante portate in Spagna da Alessandro Malaspina nel 1794. Nel corso della guerra d'indipendenza spagnola del 1808 il giardino venne abbandonato, ma nel 1857 il suo direttore Mariano de la Paz Graëlls y de la Aguera lo dotò di una nuova serra e sistemò la terrazza superiore. Sotto la sua direzione venne creato anche uno zoo successivamente spostato nel Parque del Buen Retiro. Fra il 1880 ed il 1890 il giardino subì delle perdite, prima per la costruzione del Ministero dell'Agricoltura, nel 1882, e quindi, nel 1886, quando perse 564 alberi a seguito di un ciclone.
Dal 1939 il giardino dipende dal Consiglio Nazionale Spagnolo delle Ricerche (CSIC) e nel 1942 venne dichiarato Giardino artistico. Nel 1974, dopo un decennio di abbandono, venne chiuso al pubblico per un restauro, che lo riportò al disegno originario, e riaperto nel 1981.
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